Xanthomonas-Infektionen und Ozonstress beeinflussen deutlich die Struktur und Interaktionen der mikrobiellen Gemeinschaft in der Pfefferphyllosphäre

May 03, 2023

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 24 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Während die physiologische und transkriptionelle Reaktion des Wirts auf biotischen und abiotischen Stress intensiv untersucht wurde, ist wenig über die Widerstandsfähigkeit assoziierter Mikrobiome und ihren Beitrag zur Toleranz oder Reaktion auf diesen Stress bekannt. Wir untersuchten den Einfluss von erhöhtem troposphärischem Ozon (O3), einzeln und in Kombination mit einer Xanthomonas perforans-Infektion, unter Feldbedingungen mit offener Kammer auf den Gesamtverlauf der Krankheit bei resistenten und anfälligen Pfeffersorten sowie auf die damit verbundene Mikrobiomstruktur, -funktion und das Interaktionsnetzwerk über die gesamte Vegetationsperiode hinweg. Eine Pathogeninfektion führte bei der anfälligen Sorte zu einer ausgeprägten mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und -funktion, während gleichzeitiger O3-Stress die Gemeinschaftsstruktur und -funktion nicht weiter veränderte. Allerdings verschlimmerte O3-Stress die Krankheitsschwere bei resistenten Sorten. Dieser veränderte Schweregrad der Erkrankung ging mit einer erhöhten Heterogenität der damit verbundenen Xanthomonas-Populationszahlen einher, obwohl keine signifikante Verschiebung der Gesamtdichte der Mikrobiota, der Struktur und Funktion der Mikrobengemeinschaft erkennbar war. Mikrobielle Koexistenznetzwerke unter gleichzeitigem O3-Stress und Krankheitserregerbelastung deuteten auf eine Verschiebung der einflussreichsten Taxa und ein weniger verbundenes Netzwerk hin, was möglicherweise die veränderte Stabilität der Interaktionen zwischen Gemeinschaftsmitgliedern widerspiegelt. Eine erhöhte Krankheitsschwere bei resistenten Sorten kann durch ein solches verändertes mikrobielles Koexistenznetzwerk erklärt werden, was auf den veränderten mikrobiomassoziierten prophylaktischen Schutz gegen Krankheitserreger unter erhöhtem O3 hinweist. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mikrobielle Gemeinschaften deutlich auf einzelne und gleichzeitige Stressfaktoren reagieren, in diesem Fall O3-Stress und Krankheitserregerinfektionen, und eine wichtige Rolle bei der Vorhersage spielen können, wie sich die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern angesichts des Klimawandels verändern würden.

Die Phyllosphäre (oberirdische Teile) von Pflanzen ist ein einzigartiger, nährstoffarmer Lebensraum und wird von verschiedenen prokaryotischen und eukaryotischen Mikroorganismen bewohnt [1], die entweder die Blattoberfläche (Epiphyten) oder das Blattgewebe (Endophyten) besiedeln [2, 3] . Der Aufbau und die Sukzession der mikrobiellen Blattgemeinschaft werden durch deterministische und stochastische Prozesse beeinflusst. Obwohl die Ausbreitung von benachbarten Pflanzen und andere demografische Faktoren wie die Identität und das Alter der Nachbarn zur Diversität des Mikrobioms in der Phyllosphäre beitragen [4], prägen pflanzliche Wirtsfaktoren wie der Genotyp des Wirts, das Entwicklungsstadium [5] und die Wirtsresistenz [6] die Zusammensetzung des Mikrobioms . Diese Wirtsfilterung des Mikrobioms wird aufgrund unterschiedlicher Ressourcenverfügbarkeit auf der Blattoberfläche [7], unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften [8] und Wirtsabwehrsignalen [9, 10] beobachtet.

Es ist bekannt, dass Mitglieder des Phyllosphären-Mikrobioms eine Rolle bei der Nährstoffaufnahme [11], dem Pflanzenwachstum und der Produktivität [12] sowie der Toleranz gegenüber verschiedenen biotischen und abiotischen Belastungen spielen [13, 14, 15, 16, 17]. Die Invasion von Krankheitserregern ist einer der einflussreichsten biotischen Stressfaktoren, die sich auf die mikrobielle Ansammlung von Pflanzen in der Phyllosphäre auswirken [18]. Krankheitserreger können den Lebensraum durch die Sekretion von Virulenzfaktoren, Biotensiden oder Hormonen verändern und dadurch die Ressourcenverfügbarkeit für andere ansässige Kolonisatoren, einschließlich Opportunisten, erhöhen [19, 20]. Krankheitserreger können die ansässige Mikroflora auch durch Nischen- oder Ressourcenkonkurrenz beeinflussen [1, 18, 19, 21]. Als Ursache für Veränderungen in der Phyllosphärengemeinschaft wurde auch die Aktivierung pflanzlicher Abwehrsignale als Reaktion auf einen Krankheitserregerbefall angegeben [16, 22]. Unabhängig von der Quelle der Veränderung in der Phyllosphärengemeinschaft geht man davon aus, dass dominante Mitglieder die Stabilität dieser gestörten Gemeinschaft wiederherstellen [23]. Darüber hinaus deuten immer mehr Beweise darauf hin, dass Pflanzen Mikroben in der Phyllosphäre rekrutieren können, die Schutz vor Krankheitserregern bieten [24,25,26], was auf eine krankheitsunterdrückende Mikrobiomanordnung in der Phyllosphäre als Reaktion auf Krankheitserreger hinweist, ähnlich dem, was in der Rhizosphäre beobachtet wurde [ 27, 28]. Die Struktur und Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in der Phyllosphäre wird auch durch die Reaktion der Wirtspflanze auf abiotischen Stress wie Dürre [29, 30], Anstieg der Oberflächentemperatur oder Erwärmung [31,32,33], erhöhtes CO2 [34] und ultraviolette Strahlung [ 35].

Abiotische Stressfaktoren können die Anfälligkeit des Wirts gegenüber Krankheitserregern verändern, indem sie die Signalübertragung von Abwehrhormonen stören [36] und so das Auftreten von Krankheiten beeinflussen. Die gleichzeitige Exposition von Pflanzen gegenüber biotischen und abiotischen Stressfaktoren kann je nach Zeitpunkt, Art und Schwere des jeweiligen Stresses positive oder negative Auswirkungen auf die Reaktionen der Pflanzen haben, da verschiedene Abwehrsignalwege interagieren oder sich gegenseitig hemmen können [37, 38]. Darüber hinaus haben neuere Arbeiten gezeigt, dass der Klimawandel aufgrund der Ausbreitung von Krankheitserregern außerhalb ihres geografischen Verbreitungsgebiets zu einer erhöhten Häufigkeit von Krankheitsausbrüchen führen kann [39]. Insgesamt gibt es viele interne und externe Faktoren, die das Phyllosphären-Mikrobiom prägen können, und es bedarf noch weiterer Arbeit, um die Rolle, die das Phyllosphären-Mikrobiom bei der Reaktion der Pflanze auf gleichzeitige biotische und abiotische Stressfaktoren spielt, vollständig zu verstehen.

Ein solcher abiotischer Stressfaktor, dem Pflanzen ausgesetzt sind, ist ein erhöhter Gehalt an troposphärischem Ozon (O3). Die durch Treibhausgase verursachte globale Erwärmung hat zu einem Anstieg des troposphärischen O3 aufgrund der Zunahme von Vorläufern wie Stickoxiden (NOx), CO, Methan und anderen flüchtigen organischen Verbindungen geführt [40, 41]. Eine Studie in den USA prognostizierte, dass das 5. bis 95. Perzentil für den täglichen 8-Stunden-O3-Höchstwert von 31 bis 79 Teilen pro Milliarde (ppb) im Jahr 2012 auf 30 bis 87 ppb im Jahr 2050 ansteigen wird [42]. Dieser Anstieg des O3-Spiegels ist signifikant, da O3-Konzentrationen über 40 ppb stark phytotoxisch sind [43]. Ein erhöhter O3-Gehalt kann sich negativ auf Pflanzen und auf vielen Ebenen auswirken, einschließlich sichtbarer Schäden und einer Verringerung der Photosynthese, was sich wiederum auf das Pflanzenwachstum, den Nährwert, den Ernteertrag und Veränderungen der Kohlenstoffverteilung auswirkt [43,44,45]. Während wir mehr darüber erfahren, wie mit dem Klimawandel verbundene abiotische und biotische Stressfaktoren die Pflanzenreaktion auf molekularer, zellulärer oder transkriptomischer Ebene beeinflussen, sind wichtige Fragen zu klären, wie das damit verbundene Mikrobiom auf die Reaktion der Pflanze reagieren oder zu dieser beitragen würde, wenn einzelne oder gleichzeitige Stressfaktoren vorhanden sind ob kritische ökologische Funktionen mikrobieller Gemeinschaften in der Phyllosphäre in Gegenwart von Stressfaktoren verändert würden.

Um diese Fragen zu beantworten, haben wir uns explizit auf die Reaktion des Phyllosphären-Mikrobioms von zwei Pfeffersorten konzentriert, die sich in ihrer Resistenz gegen einen Blattpathogen, Xanthomonas perforans, in Gegenwart von Umgebungs- und erhöhten O3-Werten unterscheiden. Wir verwendeten vor Ort einen Versuchsaufbau mit offenen Kammern (OTCs), der es uns ermöglichte, den O3-Spiegel zu manipulieren und den Einfluss von Wechselwirkungen zwischen Genotyp und Umwelt (G x E) auf das Gesamtergebnis von Pflanzenkrankheiten sowie auf die Mikrobiomstruktur zu untersuchen und Funktion. Die beiden in dieser Studie verwendeten Pfeffersorten unterschieden sich in ihrer Resistenz gegen X. perforans, einen neu auftretenden Pfefferpathogen im Südosten der USA: Die eine war die anfällige Sorte Early Cal Wonder und die andere die kommerzielle Sorte PS 09979325, die größtenteils im Südosten der USA verbreitet und bekannt ist eine polygene quantitative Resistenz gegen alle elf Rassen des bakteriellen Fleckenerregers zu haben [46]. Dieses spezifische Wirts-Pathosystem ermöglichte es uns nicht nur, die Reaktion der resistenten Sorte unter kombinierten Stressfaktoren zu untersuchen und so ihre Haltbarkeit unter veränderten klimatischen Bedingungen zu beurteilen, sondern auch die Reaktion der neu auftretenden pfefferpathogenen Art X. perforans zu testen [47] , auf die anfälligen und kommerziell resistenten Sorten unter einer veränderten Umgebung. Wir stellten die Hypothese auf, dass mikrobielle Gemeinschaften in der Phyllosphäre unabhängig von der Sorte Veränderungen sowohl im taxonomischen als auch im funktionellen Profil sowie eine veränderte saisonale Dynamik als Reaktion auf veränderte O3-Werte zeigen werden. Interessanterweise hängt der Einfluss von erhöhtem O3 auf die Pflanzenanfälligkeit von der Lebensweise des Krankheitserregers ab. Solche unterschiedlichen Effekte könnten auf physiologische Unterschiede, die Pathogenbiologie oder Unterschiede in den Signalwegen der Abwehr zurückzuführen sein [48,49,50]. Wir stellten die Hypothese auf, dass das Vorhandensein von erhöhtem O3 die allgemeine Anfälligkeit von Pfeffer für bakterielle Xanthomonaden-Flecken erhöht, selbst bei der resistenten Sorte. Wir stellten außerdem die Hypothese auf, dass die Entstehung einer Krankheit die saisonale Dynamik des Phyllosphären-Mikrobioms stören würde und dass dieser Effekt in Umgebungen, die einen hohen Krankheitsdruck unterstützen, stärker sein wird. Unser experimentelles Design ermöglichte es uns, den Einfluss von erhöhtem O3 auf den Gesamtverlauf der Krankheit bei Sorten zu untersuchen, die sich in ihrer Resistenz gegenüber Krankheitserregern unterscheiden, und erleichterte die Beurteilung taxonomischer und funktioneller Profile des Phyllosphären-Mikrobioms unter gleichzeitigen Stressfaktoren. Da Studien schließlich auf die Bedeutung von Funktionen und nicht von Arten für die Struktur und Zusammensetzung von Gemeinschaften hingewiesen haben [51], haben wir schließlich Funktionsprofile von Mikrobiomen verglichen, um festzustellen, ob ökologische Funktionen der Gemeinschaft unabhängig von biotischen oder abiotischen Stressfaktoren eher erhalten bleiben.

Das Experiment wurde am Standort Atmospheric Deposition (AtDep) der Auburn University (Abb. S1A) in der Vegetationsperiode 2021 (Mai–Juli) durchgeführt, wo wir OTCs (Abb. S1B) nutzten, mit denen wir die Wirkung von O3-Stress testen konnten zu Wechselwirkungen zwischen Pflanzen, Krankheitserregern und Mikrobiomen und befassen sich mit der Komplexität des Kompromisses zwischen pflanzlicher Abwehr und Entwicklung. Wir verwendeten 12 Kammern zur Begasung, wobei sechs Kammern eine Umgebungsumgebung und sechs Kammern einen erhöhten O3-Gehalt aufwiesen (Abb. S1A). Jede erhöhte O3-Kammer enthält vier O3-Generatoren (Ozongenerator HVAC-1100, Ozone Technologies, Hull, IA, USA), die mit zwei UV-Lampen (Modell GPH380T5VH/HO/4 P, Ozone Technologies, Hull, IA, USA) zur Erzeugung ausgestattet sind der O3. Generatoren und Glühbirnen befinden sich in den erhöhten O3-Kammer-Ventilatorkästen. Um den gewünschten O3-Sollwert (~100 ppb) zu erreichen, wurden O3-Generatoren über 0–10-V-Steuerkabel gesteuert, die über ein analoges Ausgangsmodul gesteuert werden. Um die Pflanzen zu begasen, wurde die ozonisierte Luft aus dem Ventilatorkasten in die Kunststoffauskleidung der oben offenen Kammer geblasen (Abb. S1B). Die Kunststoffplatte im unteren Teil der Kammer ist doppelwandig und verfügt über Löcher in der Innenplatte, sodass O3 über die Pflanzen in der Kammer abgegeben werden kann. Jede Kammer ist über Kunststoffschläuche mit einem zentralen Gasverteiler verbunden, zu dem jede Kammer nacheinander über 3-Wege-Magnetventile geöffnet wird. Ein Mikrocontroller durchläuft alle 24 Minuten die 12 Magnetventile (wobei jede der 12 Kammern 2 Minuten lang beprobt wird), um O3 aus jeder Kammer (Modell 205 Dual Beam Ozone Monitor, 2B Technologies, Boulder, CO, USA) während des Begasungsfensters zu überwachen ( 10 bis 18 Uhr). Während dieses Experiments betrug der durchschnittliche [O3] in den Kontrollkammern etwa 30,6 ppb, während die begasten Kammern einen durchschnittlichen [O3] von etwa 90,3 ppb aufwiesen (Abb. S1C). Die O3-Werte in den Hochkammern waren während der Vegetationsperiode im Vergleich zu den Umgebungskammern deutlich höher (Kruskal-Wallis, p = 0,04), während die O3-Werte zwischen den Hochkammern ähnlich waren (p = 0,62).

Die Inokulation erfolgte an 5–6 Wochen alten Sämlingen beider Sorten. Die Pflanzen wurden mit einer X. perforans-Suspension, eingestellt auf 106 KBE/ml, in MgSO4-Puffer, angereichert mit 0,0045 % (Vol/Vol) Silwet L-77 (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS, USA), inokuliert. Die Kontrollpflanzen wurden in MgSO4-Puffer, angereichert mit 0,0045 % (Vol./Vol.) Silwet L-77, tauchgeimpft (Abb. S1D). Die tauchinokulierten Pflanzen wurden in sterile 10-Zoll-Kunststofftöpfe (The HC Companies, OH) mit erdlosem Topfmedium (Premier Tech Horticulture, PA) umgepflanzt. Die Töpfe wurden dann in die oben genannten OTCs überführt und während der gesamten Vegetationsperiode bis zur Ernte in den OTCs aufbewahrt. In jeder der Kammern hatten wir sechs Pflanzen, jeweils Early Cal Wonder (im Folgenden als anfällige Sorte bezeichnet) und PS 09979325 (im Folgenden als resistente Sorte bezeichnet) (Abb. S1E). Unter den 12 Kammern wurden Pflanzen in 6 Kammern (drei Umgebungs- und drei erhöhte O3-Kammern) mit dem Pathogen X. perforans beimpft, während in sechs Kammern (drei Umgebungs- und drei erhöhte O3-Kammern) Kontrollpflanzen mit MgSO4-Puffer beimpft wurden (Abb. S1A).

Die allgemeine Krankheitsentwicklung wurde durch Schätzung des Prozentsatzes der durch Bakterienflecken verursachten Krankheitssymptome nach Transformation der Horsfall-Barratt-Bewertungen [52] in die Mitte des Bewertungsbereichs sowohl in der Mitte als auch am Ende der Saison [53] bewertet.

Pfefferblattproben wurden sowohl von inokulierten Proben als auch von Kontrollproben jeder Sorte getrennt nach der Inokulation mit Xanthomonas oder MgSO4-Puffer und vor dem Halten der Pflanzen in den Kammern (Basisproben) gesammelt, gefolgt von zwei weiteren Zeitpunkten während der Vegetationsperiode (Mitte und Ende). die Saison). Für jeden Zeitpunkt wurden Blätter von 6 Pflanzen jeder Sorte, die in einer Kammer gewachsen waren, gepoolt, sodass wir eine Probe pro Sorte haben. Während der Probenahme wurden die Blätter nach dem Zufallsprinzip gesammelt, um eine Tendenz zu erkrankten Blättern zu vermeiden, und zwar mit mindestens einem Blatt pro Pflanze und jeder Sorte. 40 Gramm Blattproben wurden 15 Minuten lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (50 mM), angereichert mit 0,02 % Tween 20, beschallt, und die abgelösten Zellen wurden pelletiert und für die DNA-Extraktion verarbeitet. Kurz gesagt, die gesamte DNA wurde mit dem Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Zugabe von Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und anschließender Ethanolfällung extrahiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines Qubit 3.0-Fluorometers (Thermo Fischer, Waltham, MA) quantifiziert und die DNA-Proben wurden zur Bibliotheksvorbereitung und am gepaarten Ende an den Sequenzierungskern des Duke Center for Genomic and Computational Biology (Duke University, Durham, NC) übermittelt Lesevorgänge (2 × 150 bp) wurden auf dem NovaSeq 6000 S1-Durchflusszellensystem sequenziert. Die Rohdaten wurden dann mit BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/) auf Qualität getrimmt, gefolgt von der Entfernung der Wirtskontamination mit KneadData (https://bitbucket.org/biobakery/). kneaddata/) mit Pepper CV. 59 (GCA_021292125.1) Genom als Referenz.

Qualitätskontrollierte und vom Host dekontaminierte Reads wurden taxonomisch mit Kraken2 (v2.1.2) [54] einer standardmäßigen Kraken2-Datenbank zugeordnet, die RefSeq-Bibliotheken [55] mit archaischen, bakteriellen, menschlichen und viralen Sequenzen enthält (Stand: 1. März 2022). Kraken2 ist ein kmer-basiertes Short-Read-Klassifizierungssystem, das jedem Sequenzierungs-Read eine taxonomische Identifizierung zuweist, indem es den niedrigsten gemeinsamen Vorfahren (LCA) passender Genome in der Datenbank verwendet und für die hochgenaue Klassifizierung metagenomischer Reads verwendet wurde (56, 57). Kraken2-Berichtsdateien wurden als Eingaben verwendet, um eine bayesianische Neuschätzung der Häufigkeit mit dem Kraken (Bracken) (v2.6.2) [58] durchzuführen, um die Häufigkeit bei jedem taxonomischen Rang für alle Proben neu zu schätzen. Bracken verwendet die von Kraken zugewiesenen Taxonomiebezeichnungen, um die Häufigkeit jeder Art abzuschätzen. Die Datenbank für Bracken wurde anschließend mit der Kraken2-Datenbank unter Verwendung der standardmäßigen Leselängen von 35 k-mer und 100 bp basierend auf der durchschnittlichen Leselänge in unserer Stichprobe mit der niedrigsten Leselänge erstellt, um die relative Häufigkeit mikrobieller Gemeinschaften neu abzuschätzen Artenebene. Die Ausgaben von Bracken wurden mithilfe der Funktion „combine_bracken_outputs.py“ für die nachgelagerte Analyse kombiniert. Das Tool kraken-biom (https://github.com/smdabdoub/kraken-biom) wurde verwendet, um die Ausgabe von Bracken in Tabellen im BIOM-Format für Diversitätsanalysen in R zu konvertieren [59].

Zusätzlich zur relativen Häufigkeit für jedes Taxon haben wir eine Schätzung der absoluten Häufigkeit basierend auf der relativen Häufigkeit verschiedener Bakterientaxa und der gesamten aus jeder Probe gewonnenen DNA berechnet. Für jede Probe wurde die Mikrobiota-Dichte berechnet, die als Gesamt-DNA (ng) pro mg frischer Probe beschrieben wird. Diese wurde dann zur Berechnung der absoluten Häufigkeit verschiedener mikrobieller Taxa verwendet, definiert durch ng DNA pro mg Probe multipliziert mit der relativen Häufigkeit [60]. ].

Auf die taxonomische Zusammensetzung und Diversität der Eukaryoten in den Proben wurde mit EukDetect (v1.3) zugegriffen [61]. EukDetect gleicht die metagenomischen Lesevorgänge mit universellen Markergenen aus konservierten Genfamilien ab, die aus Genomen und Transkriptomen von Pilzen, Protisten, Nicht-Wirbeltier-Metazoen und Nicht-Streptophyten-Archaeplastidaen kuratiert wurden, gefolgt von einer Filterung minderwertiger und doppelter Lesevorgänge. Die endgültige Häufigkeit der Eukaryoten wird berechnet, indem Taxa mit weniger als vier Lesevorgängen gefiltert und auf weniger als zwei Markergene ausgerichtet werden. Die resultierende absolute Häufigkeit (Reads Per Kilobase of Sequence) wurde verwendet, um die Diversität zwischen den Proben zu vergleichen. Der RPKS-Wert wurde durch Multiplikation mit einem Skalierungsfaktor normalisiert, der durch Division der mittleren Bibliotheksgröße durch die Probenbibliotheksgröße berechnet wurde, der dann zum Vergleich der Proben verwendet wurde.

Um den Einfluss von Sorte und Umwelt auf die Häufigkeit von X. perforans zu bestimmen, wurde eine kulturabhängige Methode zur Verfolgung der In-planta-Population von Xanthomonas verwendet. Pflanzen (6 von jeder Sorte/Kammer) wurden wie zuvor beschrieben tauchgeimpft und in den Kammern bei Umgebungstemperatur und erhöhtem O3 gehalten. Am Tag 0, 7 und 14 nach der Inokulation wurden Blattproben entnommen, um die In-Planta-Bakterienpopulation zu bestimmen. Zu jedem Probenahmezeitpunkt wurden etwa 4 cm2 Blattfläche mit einem sterilen Korkbohrer entnommen und mit einem sterilen Dremel® in Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem 0,01 M MgSO4-Puffer mazeriert. Die homogenisierte Suspension wurde dann um das Zehnfache verdünnt und anschließend mit einem Spiralplattierer (Neu-tecGroup Inc., NY) auf eine Nähragarplatte ausplattiert. Anschließend wurden die Platten 3 Tage lang bei 28 °C inkubiert und die Bakterienpopulation als koloniebildende Einheiten pro Quadratzentimeter Blattfläche bestimmt.

Alle statistischen Analysen und Diversitätsanalysen wurden mit R (v4.1.3) [59] und Rstudio [62] mit Phyloseq (v1.38.0) [63], vegan (v2.5–7) [64] und ggplot2 (v3) durchgeführt .3.5) [65] Pakete. Vor der Datenanalyse wurde die Bibliotheksgröße mithilfe der Skalierung mit geordneter Unterabtastung mit der „SRS“-Funktion im SRS R-Paket (v0.2.2) normalisiert [66]. Die Alpha-Diversitätsmessungen Chao1 und Shannon-Index wurden verwendet, um den Reichtum bzw. die Vielfalt der Gemeinschaft zu ermitteln. Der Wilcoxon-Rangsummentest testete signifikante Unterschiede in den Alpha-Diversitätsindizes für nichtparametrische Daten und der T-Test für normalverteilte Daten. Die Eignung dieser Methoden wurde überprüft, indem die Normalverteilung der Residuen anhand des Shapiro-Wilk-Normalitätstests überprüft wurde.

Die Unterschiede in den gesamten mikrobiellen Profilen zwischen den Sorten und verschiedenen Umweltbedingungen (β-Diversität) wurden mithilfe der Bray-Curtis-Distanz geschätzt. Um die Faktoren zu verstehen, die zur mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur beitragen, haben wir eine permutationsmultivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) [67] durchgeführt, wie sie in adonis2 (Varianzanalyse unter Verwendung von Distanzmatrizen, ADONIS) implementiert ist, wobei das Argument „by“ auf „margins“ und gesetzt ist Ähnlichkeitsanalyse (ANOSIM) mit 1000 Permutationen (p = 0,05) unter Verwendung der Bray-Curtis-Unähnlichkeit im veganen R-Paket (Version 2,5–7). Darüber hinaus wurde ein multivariater Gruppenhomogenitätstest (BETADISPER) (68) durchgeführt, um die homogene Dispersion zwischen den Faktoren in Bezug auf ihre mikrobiellen Taxa zu bestimmen. Die nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung (NMDS) zwischen den Stichprobengruppen wurde mithilfe der Bray-Curtis-Unähnlichkeit berechnet und mithilfe des ggplot2-Pakets in R visualisiert.

Für unsere Netzwerkanalyse wurden die taxonomischen Daten auf eine relative Häufigkeit von mindestens 0,5 % in über 20 % der Proben (Prävalenz) aufgeteilt, um sicherzustellen, dass alle Proben über eine ausreichende Sequenzierungstiefe verfügten, um den größten Teil der Diversität wiederherzustellen. Die Korrelationsnetzwerkanalyse wurde unter Verwendung des SPRING-Ansatzes [69] durchgeführt, der im R-Paket NetCoMi (v1.1.0) [70] implementiert ist. Die Gemeinschaftsstrukturen im gesamten Behandlungsgebiet wurden mithilfe des „cluster_fast_greedy“-Algorithmus [71] geschätzt, und Hub-Taxa wurden mithilfe des Schwellenwerts von 0,95 bestimmt. Ein Jaccard-Index wurde verwendet, um Ähnlichkeiten (Jacc = 0, niedrigste Ähnlichkeit und Jacc = 1, höchste Ähnlichkeit) in ausgewählten lokalen Netzwerkzentralitätsmaßen (Grad, Zwischenzentralität, Nähezentralität und Eigenvektorzentralität) zu testen, um die Hub- oder Keystone-Taxa zu bestimmen . Eine quantitative Netzwerkbewertung wurde mit einem Permutationsansatz (1000 Bootstraps) mit einer adaptiven Benjamini-Hochberg-Korrektur für mehrere Tests durchgeführt.

Die funktionelle Profilierung der mikrobiellen Gemeinschaften wurde an verketteten Paired-End-Sequenzen mit HUMAnN3 (v3.0) (72) durchgeführt, um die Genhäufigkeit (UniRef90-Genfamilien) (73) und MetaCyc-Signalwege (74) zu quantifizieren. Die ChocoPhlAn-Nukleotiddatenbank v30 wurde zur Abschätzung der Häufigkeit und Abdeckung von Funktionswegen verwendet. Die Genfamilien und Signalweghäufigkeitstabellen wurden summennormalisiert auf Kopien pro Million Lesevorgänge (CPM), um Vergleiche zwischen Proben mit unterschiedlichen Sequenzierungstiefen zu erleichtern. Die Ausgabe von HUMAnN3 wurde dann in QIIME2 (v2021.11) [75] importiert, um Ordinationen mit nichtmetrischer mehrdimensionaler Skalierung (NMDS) mithilfe der unähnlichen Bray-Curtis-Matrix zu generieren. Um die Faktoren zu verstehen, die Funktionsprofile bestimmen, führten wir eine permutationsmultivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) [67] durch, wie sie in adonis2 (Varianzanalyse unter Verwendung von Distanzmatrizen, ADONIS) und einer Ähnlichkeitsanalyse (ANOSIM) mit 1000 Permutationen (p = 0,05) implementiert ist ) mit unterschiedlichen Faktoren (Sorten, Umgebung, Impfstatus und Zeitpunkt der Probenahme), wie oben beschrieben. Unter Verwendung des LEfSe (Linear diskriminant Analysis Effect Size) (v1.1.2) (v1.1.2) wurden unterschiedlich häufig vorkommende Pfade über die Behandlung hinweg identifiziert [76]. Pfade mit einem korrigierten p-Wert von 0,05 oder weniger und einem LDA-Wert (Linear Discriminant Analysis) von log > 2,5 wurden innerhalb einer der beiden Gruppen als signifikant erhöht eingestuft.

Insgesamt wurde bei der anfälligen Sorte im Vergleich zur resistenten Sorte ein höherer Krankheitsschwereindex festgestellt. Unter Umgebungsbedingungen unterstützte die anfällige Sorte in der Zwischensaison einen Krankheitsschwereindex von durchschnittlich 53,01 %, der bis zum Ende der Vegetationsperiode auf 15,11 % sank. Die resistente Sorte unterstützte minimale Krankheiten mit einem Krankheitsschwereindex von 0,37 % in der Zwischensaison und 0,29 % am Ende der Saison. Ein erhöhter O3-Wert hatte keinen Einfluss auf die Schwere der Krankheit bei der anfälligen Sorte. Allerdings wurde bei der resistenten Sorte unter erhöhten O3-Bedingungen sowohl in der Saisonmitte (12,61 %) (p < 0,001) als auch am Ende der Saison (2,01 %) (p = 0,01) im Vergleich zur Umgebungstemperatur ein signifikant höherer Krankheitsschwereindex beobachtet Umwelt (Mitte der Saison = 0,37 %, Ende der Saison = 0,29 %) (Abb. 1, Tabelle S1).

Box- und Whisker-Diagramme, die den Krankheitsschwereindex (dargestellt als %-Wert) unter erhöhten O3- und Umgebungsbedingungen für anfällige und resistente Sorten zeigen. Signifikanzniveaus für jede Behandlungskombination werden durch *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Die zu Beginn des Experiments (Basisproben) und zweimal während der Vegetationsperiode (Mitte der Saison und Ende der Saison) gesammelten Proben wurden einer Shotgun-Metagenomsequenzierung unterzogen, die 2,83 bis 17,16 Gbit/s an Rohdaten pro Probe ergab. Das Trimmen des Adapters und das Entfernen minderwertiger Lesevorgänge führten bei verschiedenen Stichproben zu einem Verlust von 4,3 bis 11,3 % der gesamten Lesevorgänge. Von den qualitätsreduzierten Lesevorgängen wurden 5,78 bis 39,09 % der Lesevorgänge als Host-Lesevorgänge identifiziert und aus der weiteren Analyse entfernt. Die Proben im frühen Sämlingsstadium lieferten beim Filtern aufgrund der höheren Wirtskontamination (23–39 %) nur sehr wenige Messwerte, was auf eine minimale mikrobielle Besiedlung in den im Gewächshaus gezüchteten Sämlingen vor dem Umpflanzen hinweist. Etwa 50,61 % bis 84,56 % der ursprünglichen Gesamtablesungen wurden für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt (Tabelle S2).

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkung von Impfung und erhöhtem O3 und deren Wechselwirkung auf die gesamte mikrobielle Vielfalt und den Reichtum der Phyllosphärengemeinschaften. Die Gesamtwerte für den Bakterienreichtum und die Diversität sowohl in den Proben zur Mitte als auch am Ende der Saison waren in den Kontrollpflanzen im Vergleich zu den Basisproben höher. Dies könnte auf die geringe mikrobielle Besiedlung von im Gewächshaus angebauten Basisproben zurückzuführen sein, deren Vielfalt und Reichtum bei Einwirkung natürlicher Feldbedingungen zunahm. Die eukaryotische Diversität in den Basisproben wurde nicht berechnet, da diese Proben Lesezahlen aufwiesen, die unterhalb des Schwellenwerts (weniger als 4 Lesevorgänge, die mit weniger als 2 Markergenen übereinstimmen) lagen, um als in der Probe vorhanden zu gelten. Der O3-Stress allein hatte keinen Einfluss auf den Bakterien- (Tabelle S3) und eukaryotischen Reichtum und die Diversität (Tabelle S4) in beiden Sorten. Eine Pathogeninfektion führte jedoch zu einem deutlich geringeren Bakterienreichtum (p < 0,001) (Abb. 2A) und Diversität (Kruskal-Wallis, p = 0,01) (Abb. 2B) sowie zu einem geringeren eukaryotischen Reichtum (Kruskal-Wallis, p = 0,01). ) (Abb. 2C) und Diversität (Kruskal-Wallis, p = 0,02) (Abb. 2D) bei der anfälligen Sorte unter Umgebungsbedingungen während der gesamten Vegetationsperiode im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Unter kombiniertem Stress durch Krankheitserreger und erhöhtem O3 gab es bei der anfälligen Sorte nur am Ende der Saison einen signifikanten Effekt sowohl auf den Reichtum (p = 0,01) als auch auf die Diversität (p = 0,04). Impfung und erhöhter O3 hatten keinen Einfluss auf den Bakterienreichtum (pinoc = 0,81, penv = 0,07) (Abb. 2A) und die Diversität (pinoc = 0,27, penv = 0,62) (Abb. 2B) oder den eukaryotischen Reichtum (Kruskal-Wallis, pinoc =). 0,08, penv = 0,31) (Abb. 2C) und Diversität (Kruskal-Wallis, pinoc = 0,23, penv = 0,82) (Abb. 2D) auf der resistenten Sorte. Der Zeitpunkt der Probenahme hatte einen signifikanten Einfluss auf den Bakterienreichtum und die Bakterienvielfalt (p < 0,01) in beiden Sorten.

Eine Pathogeninfektion einer anfälligen Sorte verringert jedoch den Reichtum und die Vielfalt der Mikrobengemeinschaft. A bakterieller Chao1-Reichtum und B bakterieller Shannon-Diversitätsindex in verschiedenen Umgebungen. C Diversität der eukaryotischen Gemeinschaft und D-Reichtum bei verschiedenen Behandlungen. Beimpfte Proben und Kontrollproben werden durch gelbe und grüne Balken oben angezeigt, während Umgebungs- und erhöhte O3-Behandlungen durch hellblaue bzw. rote Farbbalken unten gekennzeichnet werden.

Um die Unterschiede in der bakteriellen und eukaryotischen Gemeinschaftsstruktur zwischen Proben von zwei Pfeffersorten und zwei Umweltbedingungen zu visualisieren, wurden die taxonomischen Häufigkeitsprofile zur Berechnung der Bray-Curtis-Distanzmatrix verwendet und mithilfe der nichtmetrischen mehrdimensionalen Skalierung (NMDS) in zwei Dimensionen aufgetragen. Um den relativen Einfluss jedes Faktors und seine Wechselwirkung auf die gesamte Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft in der Phyllosphäre zu verstehen, führten wir eine PERMANOVA zu Bray-Curtis-Unähnlichkeiten durch, wobei wir Sorte, Zeitpunkt der Probenahme, Umgebung und Inokulation als unabhängige Variablen verwendeten. Insgesamt war der Einfluss der Sorte, des Zeitpunkts der Probenahme und der Inokulation von großer Bedeutung für die Bildung von Bakteriengemeinschaften (p < 0,001), zusätzlich zu den Wechselwirkungen von Sorte, Zeitpunkt und Inokulation (p = 0,03) (Tabelle S5A), mit Trennung von inokulierte anfällige Pflanzen aus kontrollempfindlichen, inokulierten und kontrollresistenten Pflanzen (Abb. 3A). Darüber hinaus haben wir den Einfluss und die Wechselwirkungen einzelner Faktoren an zwei Stichprobenpunkten untersucht. Die Wirkung der Sorte war signifikant, nahm jedoch im Laufe der Vegetationsperiode ab (Mitte der Saison: R2 = 0,23, p < 0,001; Ende der Saison: R2 = 0,06, p = 0,03). Im Gegensatz dazu nahm die Wirkung der Impfung im Laufe der Vegetationsperiode zu (Mitte der Saison: R2 = 0,20, p < 0,001; Ende der Saison: R2 = 0,55, p < 0,001) (Tabelle S5B, C). Der Effekt der Interaktion zwischen Sorte und Inokulation auf Bakteriengemeinschaften blieb im Laufe der Zeit statistisch signifikant, obwohl der Effekt am Ende der Vegetationsperiode abnahm (Mitte der Saison: R2 = 0,15, p < 0,01; Ende der Saison: R2 =). 0,05, p = 0,04). Der Effekt von erhöhtem O3 war minimal und am Ende der Vegetationsperiode statistisch nicht signifikant (Mitte der Saison: R2 = 0,05, p = 0,04; Ende der Saison: R2 = 0,02, p = 0,15) (Tabelle S5B, C). Die Wechselwirkung zwischen der Umgebung und anderen Variablen war während der gesamten Vegetationsperiode statistisch nicht signifikant. Ein Anstieg des O3-Spiegels veränderte die Struktur der Bakteriengemeinschaft auf der anfälligen Sorte nicht. Allerdings beeinflusste es die Bakteriengemeinschaften auf der resistenten Sorte (R2 = 0,14, p = 0,02) (Tabelle S5D) in Abwesenheit von Xanthomonas. Es gab keinen Unterschied in den mikrobiellen Gemeinschaften zwischen den Kammern mit erhöhtem O3 (p = 0,69) oder der Umgebungsumgebung (p = 0,85), was darauf hindeutet, dass die Kammer keinen Einfluss auf die gesamte Bakterienvielfalt hat (Tabelle S5E, F).

Eine Nonmetric Multidimensional Scaling (NMDS)-Ordination, die die Diversität der Bakteriengemeinschaft über zwei Sorten hinweg, die Umweltbedingungen und den Zeitpunkt der Probenahme vergleicht. B NMDS-Ordination zum Vergleich der Vielfalt der eukaryotischen Gemeinschaft zwischen zwei Sorten, Umweltbedingungen und Zeitpunkt der Probenahme.

Wie die Bakteriengemeinschaften wurde auch die Diversität der eukaryotischen Gemeinschaften maßgeblich von der Umgebung, der Sorte, dem Zeitpunkt der Probenahme und der Inokulation beeinflusst (p < 0,01) (Tabelle S6A, B). Die Sorte hatte einen signifikanten Einfluss auf die eukaryotische Vielfalt mit größerem Einfluss am Ende der Saison (Mitte der Saison: R2 = 0,12 (Tabelle S6C), p = 0,007; Ende der Saison: R2 = 0,37, p = 0,001 (Tabelle S6D, E)). Ein Anstieg des O3-Spiegels wirkte sich in der Zwischensaison deutlich auf die eukaryotischen Gemeinschaften aus, während er am Ende der Saison nicht signifikant war (Mitte der Saison: R2 = 0,22, p = 0,001 (Tabelle S6C); Ende der Saison: R2). = 0,06, p = 0,19 (Tabelle S6D, E). Die Wirkung der Impfung auf eukaryotische Gemeinschaften war in der Zwischensaison höher und nahm am Ende der Saison ab (Abb. 3B) (Zwischensaison: R2 = 0,15). , p = 0,003 (Tabelle S6C); Ende der Saison: R2 = 0,11 p = 0,03 (Tabelle S6D, E)). Der Einfluss der Probenahmezeit auf die Clusterbildung zeigte sich bei der Bildung sowohl bakterieller als auch eukaryontischer Gemeinschaften (Abb. 3A, B).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die mikrobiellen Gemeinschaften auf resistenten und anfälligen Sorten ähnlich waren, wenn kein Stress, weder durch Krankheitserreger noch durch erhöhten O3-Wert, auftrat, und dass der Einfluss der saisonalen Sukzession sowohl auf bakterielle als auch auf eukaryontische Gemeinschaften offensichtlich war. Eine Pathogeninfektion führte im Verlauf der Vegetationsperiode zu einer Verschiebung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft auf der anfälligen Sorte. Trotz des Vorkommens der Xanthomonas-Population auf resistenten Sorten ähnelte die Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft jedoch derjenigen, die bei nicht inokulierten Pflanzen beobachtet wurde. Trotz einer Zunahme der Krankheitsschwere bei der resistenten Sorte unter erhöhtem O3 ähnelten die Bakterien- und Eukaryotengemeinschaften in ihrer Zusammensetzung denen unter Umgebungsbedingungen.

Das Vorhandensein von Xanthomonas auf Kontrollpflanzen anfälliger und resistenter Sorten deutete auf geringe Mengen an natürlichem Inokulum im Feld hin. Allerdings stieg die relative Häufigkeit von Xanthomonas auf Kontrollpflanzen im Laufe der Zeit nicht signifikant an (<5 % bis zum Ende der Saison). Sowohl die relative als auch die absolute Häufigkeit von Xanthomonas nahm von der Saisonmitte bis zum Saisonende bei inokulierten anfälligen und resistenten Sorten zu (Abb. S2A, B). Bemerkenswert war die signifikante Variation der relativen (~33–87 %) sowie der absoluten (~13–37 %) Häufigkeit von Xanthomonas auf resistenten inokulierten Pflanzen unter erhöhten O3-Bedingungen. Das Vorhandensein von erhöhtem O3 führte jedoch nicht zu einem signifikanten Unterschied in der relativen (Kruskal-Wallis: pECW = 0,12, pX10R = 0,78) oder absoluten (Kruskal-Wallis: pECW = 0,15, pX10R = 0,54) Häufigkeit von Xanthomonas in beiden Sorten ( Abb. S2A, B). Diese Beobachtung war überraschend, da die Krankheitsschwere unter erhöhten O3-Bedingungen bei resistenten inokulierten Pflanzen deutlich höher war als unter normaler Umgebung.

Um den Einfluss von erhöhtem O3 und erhöhten Sorten auf die Xanthomonas-Population weiter zu bestätigen, analysierten wir die In-planta-Population von X. perforans, die mit einer kulturabhängigen Methode für Tag 7 und Tag 14 nach der Inokulation bestimmt wurde. Auch wenn dieses Kurzzeitexperiment möglicherweise nicht das Ergebnis der gesamten Vegetationsperiode widerspiegelt, ermöglichte es uns, die Auswirkung von erhöhtem O3 auf die Xanthomonas-Population zu bewerten. Ähnlich wie bei den obigen Beobachtungen gab es bei diesen Sorten keinen signifikanten Einfluss der Umgebung (d. h. Umgebungstemperatur vs. erhöhte O3-Konzentration) auf die X. perforans-Population (pECW = 0,31, pX10R = 0,34) (Abb. S2C).

Da der Anstieg der Krankheitsschwere bei der resistenten Sorte unter erhöhtem O3 nicht das Ergebnis von Veränderungen in der Xanthomonas-Population war, stellten wir die Hypothese auf, dass dieser Anstieg mit einer signifikanten Verringerung der gesamten mikrobiellen Dichte verbunden war, die mit der resistenten Sorte unter erhöhtem O3 im Vergleich zur Umgebungstemperatur verbunden war Umgebung, was sich auf einen veränderten prophylaktischen Schutz vor Mikrobiota unter erhöhtem O3 bezieht. Schätzungen der Mikrobiotadichte wurden auf der Grundlage des mikrobiellen DNA-Gehalts pro mg Probe erhalten, ähnlich denen, die in Darmmikrobiomstudien berechnet wurden [77]. Es gab einen signifikanten Effekt der Inokulation auf die Mikrobiota-Dichte (p < 0,001), während weder die Sorte (p = 0,15) noch erhöhte O3-Werte (p = 0,19) einen signifikanten Einfluss auf die Mikrobiota-Dichte hatten (Abb. 4A). Bei inokulierten resistenten Sorten unter erhöhtem O3-Gehalt war die Mikrobiota-Dichte in Proben zur Saisonmitte deutlich geringer als bei anfälligen Sorten (p = 0,01), nicht jedoch bei Proben zum Saisonende (p = 0,13) (Tabelle S7A–D). Wir haben die absolute Häufigkeit jeder Bakteriengattung weiter geschätzt, indem wir ihre relative Häufigkeit (Abb. 4B) mit der Gesamt-DNA pro mg Probe multipliziert haben. Die absolute Gesamthäufigkeit von Mikrobiota war bei inokulierten resistenten Sorten im Vergleich zu inokulierten anfälligen Sorten in beiden Umgebungen geringer, obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war und große Unterschiede zwischen den Proben erklärt (Abb. 4C, Tabelle S7E, F). Die absolute Gesamthäufigkeit der mit inokulierten resistenten Sorten assoziierten Mikrobiota unterschied sich unter Umgebungsbedingungen nicht wesentlich von der unter erhöhter O3-Umgebung.

Ein Box-and-Whisker-Diagramm, das die durch mikrobielle DNA-Quantifizierung (Konzentration der extrahierten DNA pro mg Blattproben) geschätzte Mikrobiotadichte für verschiedene Behandlungen in zwei Sorten zeigt. B Relative (links) und absolute (rechts) Artenhäufigkeit der 15 wichtigsten Bakterientaxa in allen Proben. Die absolute Häufigkeit wird durch Skalieren der relativen Häufigkeitsmessungen mit den Mikrobiota-Dichtemessungen ermittelt. C-Balkendiagramme, die die relative Häufigkeit der 15 wichtigsten eukaryotischen Gattungen in den Proben zeigen. Beimpfte Proben und Kontrollproben werden durch gelbe und grüne Balken oben angezeigt, während Umgebungs- und erhöhte O3-Behandlungen durch hellblaue bzw. rote Farbbalken unten gekennzeichnet werden. Der Zeitpunkt der Probenahme wird durch Base (Erstproben), Mid (Mitte der Saison) und End (Ende der Saison) angegeben.

Als nächstes untersuchten wir die zeitliche Dynamik der Gemeinschaftsbildung und -sukzession in der Phyllosphäre und verglichen die Muster zwischen inokulierten und Kontrollpflanzen. Eine detaillierte taxonomische Beschreibung von Bakterien und Eukaryoten für verschiedene Behandlungen finden Sie in den Zusatzinformationen. Die taxonomische Diversitätsanalyse zeigte, dass mehrere bakterielle (Abb. 4B, Tabelle S8) und eukaryotische Gattungen (Abb. 4C, Tabelle S9) die Phyllosphärenumgebung monopolisieren. Diese mikrobiellen Gattungen werden unterschiedlich durch das Vorhandensein eines Krankheitserregers, Umweltstress und deren Wechselwirkung beeinflusst.

Als nächstes identifizierten wir Gattungen, die Veränderungen in der relativen Häufigkeit als Reaktion auf Sorten oder erhöhten O3 zeigten. Die Bakteriengattungen Pseudomonas, Pantoea, Methylobacterium, Sphingomonas, Methylobrum usw. wurden negativ beeinflusst, während Microbacterium in Gegenwart von Xanthomonas auf einer anfälligen Sorte positiv beeinflusst wurde (Abb. S3A–F). Im Gegensatz zur anfälligen Sorte nahm die relative Häufigkeit von Pseudomonas und Sphingomonas in Gegenwart von Xanthomonas auf der resistenten Sorte zu. Die Bakteriengattung Methylobacterium wurde durch erhöhten O3 negativ beeinflusst, während die Gattungen Pseudomonas und Sphingomonas in resistenten Sorten positiv beeinflusst wurden (Abb. S3G – L). Bei den Eukaryoten wurde die Gattung Bullera durch erhöhte O3 positiv beeinflusst, während die Gattungen Epicoccum und Protomyces unabhängig von der Behandlung zeitliche Schwankungen aufwiesen (Abb. 4C).

Da die mikrobielle Zusammensetzung erheblich von Sorte, Inokulation und Zeit beeinflusst wurde, wollten wir untersuchen, ob die beobachteten taxonomischen Unterschiede nischenspezifische mikrobielle Funktionen widerspiegeln. Die Gesamtfunktionen der Gemeinschaft, basierend auf der relativen Häufigkeit von Stoffwechselwegen (Abb. 5A) sowie zugehörigen Genfamilien, die auf den Stoffwechselwegen abgebildet wurden (Abb. 5B), wurden durch diese einzelnen Faktoren nicht beeinflusst (p > 0,05) (Tabelle S10A, B ). Allerdings hatte die Wechselwirkung zwischen Inokulation, Sorte und Probenahmezeit einen signifikanten Einfluss auf mikrobielle Funktionen und Genfamilien (p < 0,01) (Tabelle S10A, B), was durch Unterschiede in der funktionellen Zusammensetzung beider Genfamilien und damit verbundenen Signalwegen angezeigt wird Gemeinschaften, die sich von der inokulierten anfälligen Sorte erholten, verglichen mit der inokulierten resistenten Sorte. Wir beobachteten einen signifikanten Effekt der Sorte am Ende der Saison (p = 0,01) (Tabelle S10C). Erhöhte O3 veränderten den funktionellen Aufbau des Phyllosphären-Mikrobioms weder bei resistenten noch bei anfälligen Sorten und unabhängig vom Inokulationsstatus. Wir beobachteten ähnliche Funktionsprofile sowohl in Bezug auf Gene als auch auf Signalwege über Zeitpunkte während der Vegetationsperiode hinweg bei den jeweiligen Sorten, trotz Unterschieden in der Artenzusammensetzung in den Proben zur Mitte und zum Ende der Saison. Dies ist wahrscheinlich auf eine erhebliche funktionelle Redundanz in den Stoffwechselwegen zurückzuführen, die mit mikrobiellen Gemeinschaften während der Vegetationsperiode verbunden sind, trotz der saisonalen Abfolge von Taxa in der Phyllosphäre.

Nonmetric Multidimensional Scaling (NMDS)-Ordination, die die Diversität der A-Stoffwechselwege über verschiedene Behandlungsbedingungen in anfälligen und resistenten Sorten hinweg anzeigt, B-Gene, die den Stoffwechselwegen über verschiedene Behandlungsbedingungen in anfälligen und resistenten Sorten zugeordnet sind.

Um unterschiedlich häufig vorkommende Signalwege zu finden, die Unterschiede zwischen den Behandlungen als Reaktion auf eine Pathogeninfektion, erhöhten O3 und deren Wechselwirkung erklären, führten wir eine lineare Diskriminanzanalyse der Effektgröße (LEfSe) durch. Bei einer Infektion mit Krankheitserregern und erhöhtem O3-Gehalt wurden Stoffwechselwege im Zusammenhang mit der Häm-Fängung (Quelle für bioverfügbares Eisen) in mikrobiellen Gemeinschaften angereichert, die aus der resistenten Sorte gewonnen wurden, wohingegen mit dem Kohlenhydratstoffwechsel (Pentosephosphatweg, Gallatabbau, Glyoxylatzyklus) und dem Schutz (Lipid) verbundene Stoffwechselwege angereichert waren IVA-Biosynthese), Wachstum und Aufrechterhaltung (Phosphatidylglycerin-Biosynthese, CDP-Diacylglycerin-Biosynthese, GDP-Mannose-Biosynthese) und Metabolismus ungesättigter Fettsäuren (Gondoat-Biosynthese) wurden in mikrobiellen Gemeinschaften angereichert, die unter Umgebungsbedingungen aus der resistenten Sorte gewonnen wurden (Abb. S4A). ). Zu den Stoffwechselwegen, die in mikrobiellen Gemeinschaften beider Sorten bei O3-Stress angereichert wurden, gehörten Wege, die an der Primärenergieerzeugung und dem Abbau ungesättigter Fettsäuren (Beta-Oxidation, Pentosephosphat) beteiligt sind, verschiedene Abwehrwege gegen Sauerstoffstress und DNA-Reparatur (Ubiquinol 7, Pyrimidin(desoxy)nukleotide) und Wege im Zusammenhang mit der sauerstoffunabhängigen Atmung (sauerstoffunabhängige Häm-b-Biosynthese) (Abb. S4B). In Gegenwart sowohl des Pathogens als auch von erhöhtem O3 wurde der Signalweg im Zusammenhang mit der Produktion und dem Abbau von Purinnukleotiden angereichert (Abb. S4C).

Um zu beurteilen, ob eine Pathogeninfektion und O3-Stress allein oder in Kombination die gesamte mikrobielle Assoziation in der Phyllosphäre beeinflussten, wurden bakterielle Koexistenznetzwerke und ihre topologischen Merkmale über die Behandlungen hinweg verglichen. Wir bewerteten lokale Netzwerkzentralitätsmaße anhand von Grad, Zwischenwert, Nähe und Eigenvektorzentralität, um Hub-Taxa für bakterielle Koexistenznetzwerke unter erhöhtem O3 (Abb. 6A), Inokulation (Abb. 6B) und kombiniertem Stress von erhöhtem O3 und Krankheitserregern zu bestimmen (Abb. 6C) und mit der Umgebung, der Kontrollbedingung bzw. der Kontrollbedingung und der Umgebungsumgebung verglichen. Wir haben festgestellt, dass alle oben genannten Behandlungsvergleiche signifikante Unterschiede für alle lokalen Netzwerkzentralitätsmaße zeigten (Tabelle S11A). Ein Hub-Taxon ist ein stark vernetztes Taxon und hat bekanntermaßen einen starken Einfluss auf das Netzwerk. Beim Vergleich der Kontrolle mit inokulierten Proben oder der Kontrolle und der Umgebung mit Pathogen- und O3-Stress gab es einen signifikanten Unterschied bei den Hub-Taxa zwischen den Behandlungsgruppen (Tabelle S11A, B). Es gab jedoch keine Veränderung der Hub-Taxa bei Pflanzen, die im Vergleich zur Umgebungsumgebung erhöhtem O3 ausgesetzt waren.

Vergleich des bakteriellen Assoziationsnetzwerks in verschiedenen Umgebungen. Ein bakterielles Assoziationsnetzwerk für den kombinierten Datensatz von Umgebungs- (oben) und erhöhtem O3 (unten) in beiden Sorten unter Kontrollbedingungen. B Bakterienassoziationsnetzwerk für den kombinierten Datensatz aus Kontrollproben (oben) und inokulierten Proben (unten) beider Sorten unter Umgebungsbedingungen. C Bakterienassoziationsnetzwerk für den kombinierten Datensatz aus Kontroll- und Umgebungsproben (oben) sowie inokulierten und erhöhten O3-Proben (unten) beider Sorten. Hub-Taxa werden durch fetten Text hervorgehoben. Die Knotenfarbe stellt den Cluster dar, der durch gierige Modularitätsoptimierung bestimmt wird. Rote Kanten entsprechen negativen Korrelationen, während grüne Kanten positiven Korrelationen entsprechen.

Der Vergleich der Gesamtähnlichkeiten der beiden Netzwerke zwischen Umgebungsstress und individuellem Stress oder kombiniertem Stress aus erhöhtem O3 und Krankheitserreger auf der Grundlage des angepassten Rand-Index (ARI) ergab Werte nahe 0 (ARI = 0,02, p = 0,07) für Umgebungsstress und erhöhtem Stress O3-Stress; Kontrolle vs. geimpft (ARI = 0,03, p = 0,02) und Kontrolle und Umgebung vs. kombinierter Stress (ARI = 0,10, p < 0,001) (Tabelle S11C). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Aufteilung der Arten in Gemeinschaften in diesen Vergleichen einen geringen Grad an Ähnlichkeit aufweist. Diese Ergebnisse, mit Unterschieden in der Topologie zwischen diesen Netzwerken und Unähnlichkeit bei den Messungen der lokalen Netzwerkzentralität, deuten darauf hin, dass die Kombination von Pathogeninfektion und O3-Stress zu Verschiebungen in den Interaktionen der Bakteriengemeinschaft in der Phyllosphäre führt.

Als nächstes bewerteten wir globale mikrobielle Netzwerkeigenschaften wie die Anzahl der Kanten als Maß für Komplexität, Modularität, durchschnittliche Pfadlänge und Clusterkoeffizient, die Netzwerktopologien über Behandlungen hinweg vergleichen [78, 79]. Die aktuelle Version von NetCoMi kann aufgrund der hohen Laufzeit eines einzelnen Netzwerkaufbaus nur 1000 Permutationen durchführen. Da der minimal mögliche p-Wert für 1000 Permutationen 1/1000 beträgt, ist die Trennschärfe recht gering, was nach Anpassung für mehrere Tests zu großen p-Werten führt. Eine zunehmende Anzahl von Permutationen könnte die Bewertung globaler Netzwerkeigenschaften mit ausreichender statistischer Aussagekraft ermöglichen. Daher haben wir uns in dieser Studie auf absolute Unterschiede für jeden zu vergleichenden Parameter konzentriert und nicht auf die zugehörigen p-Werte. Mikrobielle Netzwerke zeigten unter Umgebungstemperatur einen höheren Prozentsatz positiver Kanten, einen höheren Clusterkoeffizienten und eine geringere durchschnittliche Pfadlänge im Vergleich zu erhöhtem O3 (Tabelle S11D). Dies lässt auf positivere Interaktionen in Umgebungen schließen und darauf, dass O3-Stress weniger komplexe und negative Assoziationen zwischen Community-Mitgliedern fördern kann. Im Gegenteil führte das Vorliegen einer Pathogeninfektion zu einem positiveren Kantenprozentsatz, einer geringeren Pfadlänge, einer höheren Modularität und einem höheren Clusterkoeffizienten, was darauf hindeutet, dass alle Knoten innerhalb der Netzwerke stark miteinander verbunden waren, um bei einer Pathogeninfektion ein komplexeres und stabileres Netzwerk zu bilden (Tabelle S11D). Bei Vorliegen einer Pathogeninfektion und O3-Stress wurden jedoch positivere Wechselwirkungen unter Umgebungs- und Kontrollbedingungen mit geringerer Pfadlänge und höherem Clusterkoeffizienten festgestellt, was darauf hindeutet, dass kombinierter Stress möglicherweise weniger komplexe und weniger stabile Assoziationen zwischen Gemeinschaftsmitgliedern hervorruft (Tabelle S11D). ).

Der Klimawandel und moderne landwirtschaftliche Praktiken haben die Agrarökosysteme einer erhöhten Bedrohung durch Schädlinge ausgesetzt und lassen uns daher unvorhersehbar, wie sich Pflanzen an die gleichzeitigen biotischen und abiotischen Stressfaktoren anpassen werden. Viele Studien haben die Rolle pflanzenassoziierter Mikrobiome bei der Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegenüber dem sich ändernden Klima und der Ausweitung der Pflanzenimmunität gegen Krankheitserreger vorgeschlagen [24, 30, 80, 81]. Wir müssen jedoch noch vollständig verstehen, wie mikrobielle Gemeinschaften bei gleichzeitiger Anwesenheit biotischer und abiotischer Stressfaktoren auf die Pflanzenanpassung reagieren und zu dieser beitragen. In dieser Studie haben wir individuelle und gleichzeitige Auswirkungen von erhöhtem O3 und Krankheitserregerstress auf die Struktur, Funktion und Stabilität der Bakterien- und Eukaryotengemeinschaft in der Phyllosphäre sowie auf die Gesamtergebnisse von Pflanzenkrankheiten bei anfälligen und resistenten Pfeffersorten getestet. Die in dieser Studie verwendete resistente Pfeffersorte verfügt über Resistenzgene, die ein mittleres Maß an Resistenz gegen alle derzeit bekannten Pfefferrassen des bakteriellen Fleckbakteriums Xanthomonas bieten [82]. Unser Grund für die Einbeziehung dieser Sorte in dieses Studiendesign bestand darin, die Haltbarkeit dieser resistenten Sorte zu verstehen, die derzeit im Südosten der USA als Reaktion auf neu auftretende Krankheitserregerarten und unter erhöhten O3-Werten, die das zukünftige Klima darstellen, weit verbreitet eingesetzt wird.

Während der offensichtliche Einfluss von erhöhtem O3 auf die Krankheitsschwere bei der anfälligen Sorte nicht beobachtet wurde, zeigte die resistente Sorte während der gesamten Vegetationsperiode bei erhöhtem O3 im Vergleich zur Umgebungsumgebung eine höhere Krankheitsschwere (Abb. 1). Diese Änderung der Schwere der Erkrankung kann auch auf eine Resistenzerosion unter erhöhten O3-Bedingungen hinweisen. Leider hindert uns die Auswahl der in dieser Studie verwendeten Sorten, die nicht annähernd isogen sind, daran, den Einfluss von Resistenzorten auf das Mikrobiom zu bewerten, wie dies in früheren Studien durchgeführt wurde [83]. Die erhöhte Krankheitsschwere, die bei der resistenten Sorte unter erhöhtem O3 beobachtet wurde, war jedoch nicht mit der Zunahme der Xanthomonas-Population verbunden, wie anhand der absoluten Häufigkeitsdaten im Vergleich zur Umgebungsumgebung geschätzt wurde. Eine solche kulturunabhängige DNA-Sequenzierungsmethode gibt möglicherweise nicht genau die Anzahl lebender Krankheitserregerzellen an und rechtfertigt möglicherweise eine Bestätigung dieser Ergebnisse mit einer kulturabhängigen Schätzung der Krankheitserregerpopulation oder mit Methoden wie der quantitativen PCR (qPCR) [84, 85] und der digitalen Tröpfchen-PCR [86, 87]. Obwohl nicht für die gesamte Vegetationsperiode, haben wir die Dynamik der Xanthomonas-Population während eines zweiwöchigen Kurzzeitexperiments überwacht und die Ergebnisse bestätigten die früheren Erkenntnisse, dass die Xanthomonas-Population trotz höherer Krankheitsschwere unter erhöhtem O3 bei der resistenten Sorte unbeeinflusst blieb. Bemerkenswert ist die hohe Variabilität der Xanthomonas-Populationszahlen bei der resistenten Sorte unter erhöhtem O3. Dies kann auf eine plastische Reaktion des Pathogens während der Anpassung an die resistente Sorte unter veränderten Umgebungsbedingungen hinweisen.

Zahlreiche Arbeiten haben darauf hingewiesen, dass Klimaschwankungen einen tiefgreifenden Einfluss auf das Ergebnis von Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern haben können [88,89,90], die aus einer Veränderung der Wirtsumgebung durch Modifikation der Abwehrwege des Wirts und einer erhöhten Infektion mit Krankheitserregern resultieren können Effizienz unter veränderten Umgebungen oder Veränderungen im Mikrobiom sorgten für eine längere Immunität. Im Folgenden werden diese drei plausiblen Erklärungen dargelegt, die synergetisch die Wechselwirkungen zwischen Pflanze, Krankheitserreger und Mikrobiom vorantreiben und dabei helfen könnten, die Beobachtung aus dieser Studie einer potenziellen Resistenzerosion unter erhöhten O3-Bedingungen zu erklären.

Studien zur Reaktion von Pflanzen auf eine Kombination aus abiotischem und biotischem Stress haben eine einzigartige und komplexere Reaktion als die von Einzelstress gezeigt [38, 91, 92, 93]. Die Wirkung von kombiniertem Stress wird durch verschiedene Faktoren wie Zeit, Grad des Stresses, Pflanzengenotyp und andere Klima- oder Umweltfaktoren bestimmt und ist daher nicht unbedingt additiver Natur (94). Pflanzen reagieren auf biotischen und abiotischen Stress über komplexe, aber überlappende Abwehrsignalwege [95, 96], wobei bei abiotischem Stress die Induktion des Abscisinsäure-Signalwegs (ABA) beobachtet wird, der den an der Krankheitserregerabwehr beteiligten Salicylsäure-Signalweg (SA) antagonisiert [97]. , 98]. Gleichzeitige Belastungen durch eine Pathogeninfektion und einen erhöhten O3-Wert können zu einer veränderten Immunantwort des Wirts auf die resistente Sorte führen. Eine durch erhöhte [O3] verursachte oxidative Schädigung der Kutikula der Pflanze kann die Exposition gegenüber Krankheitserregern erhöhen und somit die Schwere der Erkrankung beeinflussen [99]. Die Ergänzung dieser aktuellen Studie durch Wirtstranskriptomik wird klären, ob eine solche Veränderung der Wirtsabwehr die erhöhte Anfälligkeit für resistente Sorten bei erhöhtem O3 erklärt. Zweitens kann eine erhöhte Pathogenvirulenz durch eine erhöhte Effektorproduktion [89] in einer veränderten Umgebung eine erhöhte Krankheitsschwere erklären, wenn es nicht zu einem signifikanten Anstieg der Pathogenpopulation kommt. Die erhöhte Variation in der Pathogenpopulation könnte entweder auf die plastische Reaktion des Wirts oder auf die Plastizität der Pathogenpopulation zurückzuführen sein.

Die dritte und wichtigste Erklärung für die Beobachtungen aus dieser Studie ist die Veränderung des mikrobiomvermittelten Schutzes der resistenten Sorte als Reaktion auf erhöhte O3- und Pathogeninfektionen. Mikrobielle Gemeinschaften, die von der resistenten Sorte in der Phyllosphäre rekrutiert werden, könnten eine schützende Rolle gegen den Krankheitserreger spielen, wie in früheren Studien gezeigt wurde [13, 100], und diese schützende Rolle könnte sich unter erhöhtem O3 verändert haben, was möglicherweise zu einer Zunahme der Krankheit geführt hat Schwere. Die Zusammensetzung, Struktur und Funktion der bakteriellen und eukaryotischen Gemeinschaft der anfälligen Sorte unterschied sich nicht, wenn keine Pathogeninfektion oder kein erhöhter O3-Wert vorlag. Allerdings wurde die Struktur der Bakteriengemeinschaft auf der resistenten Sorte durch das Vorhandensein von erhöhtem O3, jedoch in Abwesenheit des Pathogens, beeinflusst. Ob dieser unterschiedliche Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur auf spezifische Resistenzorte zurückzuführen ist, muss noch geklärt werden, da die von uns untersuchten Sorten keine annähernd isogenen Linien für die Resistenzorte darstellten. Bei der anfälligen Sorte führte das Vorliegen einer Pathogeninfektion zu einer erheblichen Veränderung der Struktur und Funktion der Bakteriengemeinschaft, auch wenn gleichzeitiger O3-Stress die Struktur und Funktion des Mikrobioms nicht weiter veränderte. Obwohl bei der resistenten Sorte nach der Infektion keine signifikante Veränderung der Mikrobiomstruktur und -funktion beobachtet wurde, war die Gesamtdichte der Mikrobiota bei der infizierten resistenten Sorte geringer als bei der infizierten anfälligen Sorte. Darüber hinaus führte der gleichzeitige O3-Stress zu einer geringeren Gesamtdichte der Mikrobiota während der Probenahme in der Zwischensaison bei der infizierten resistenten Sorte. Ob eine solche Verringerung ein beeinträchtigtes prophylaktisches Potenzial des Mikrobioms widerspiegelt, das mit einer resistenten Sorte unter dem kombinierten Einfluss von erhöhtem O3 und einer Pathogeninfektion verbunden ist, muss noch untersucht werden. Weitere Experimente zur Bewertung des mikrobiomvermittelten Schutzes vor Krankheitserregern können unter Verwendung synthetischer Gemeinschaften konzipiert werden, die mit der resistenten Sorte assoziiert sind, ähnlich wie in früheren Studien (101). Diese Experimente bieten möglicherweise Möglichkeiten, den Einfluss einer veränderten Umgebung auf die absolute Häufigkeit einzelner Mitglieder der Gemeinschaft und ihre Interaktionen sowie die damit verbundenen funktionellen Merkmale zu untersuchen. Interessanterweise zeigten unsere Daten keinen Einfluss gleichzeitiger Stressfaktoren auf die Funktionen mikrobieller Gemeinschaften, die mit der resistenten Sorte verbunden sind. Dies war überraschend, da frühere Studien auf eine Anreicherung spezifischer Stoffwechselwege unter abiotischen oder biotischen Stressfaktoren hinweisen [102,103,104].

Die mikrobielle Funktion im Ökosystem wird nicht nur durch die Anzahl und Zusammensetzung der Taxa bestimmt, sondern auch durch die verschiedenen positiven, negativen, direkten oder indirekten Assoziationen zwischen den Gemeinschaftsmitgliedern (105). Als Reaktion auf die Pathogenherausforderung beobachteten wir Netzwerkparameter, die auf ein dicht verbundenes Netzwerk hinweisen. Diese Ergebnisse einer verstärkten positiven und komplexen Assoziation zwischen den mikrobiellen Gemeinschaften bei einer Pathogeninfektion wurden sowohl in der Phyllosphäre als auch in der Endosphäre beobachtet [106,107,108]. Ein solch dicht verbundenes Netzwerk weist auf eine kooperative Assoziation wie Erleichterung, Gegenseitigkeit oder Kommensalismus und gegenseitige Einspeisung hin [79, 109]. Es wird angenommen, dass solche verbundenen Netzwerke, die als Small-World-Netzwerke bezeichnet werden [110], Widerstand gegen Störungen bieten. Im Gegensatz dazu zeigten mikrobielle Koexistenznetzwerke bei O3-Stress und gleichzeitigem Pathogen- und O3-Stress einen ähnlichen Trend eines relativ instabilen Zufallsnetzwerks im Vergleich zur Kontrollumgebung. Dieser Befund stimmt mit der Annahme überein, dass unterschiedlich starke Umweltbelastungen die Stabilität mikrobieller Gemeinschaften beeinträchtigen [79]. Die Beobachtung der Ähnlichkeit des zentralsten Knotens legt nahe, dass sich die mikrobiellen Gemeinschaften bei verschiedenen Behandlungen erheblich unterscheiden. Das Vorhandensein eines Krankheitserregers und gleichzeitiger Krankheitserreger- und O3-Stress wirkten sich erheblich auf die Hub-Taxa aus. Allerdings hatten gleichzeitige Stressfaktoren, nicht jedoch einzelne Stressfaktoren, erheblichen Einfluss auf die einflussreichsten Taxa, was darauf hindeutet, dass Pflanzen auf gleichzeitige Stressfaktoren reagieren, indem sie das einflussreichste mikrobielle Mitglied im zufälligen Netzwerk verändern. Es wäre interessant, den Einfluss einzelner Sorten und damit den Einfluss der Abwehrreaktionen des Wirts auf mikrobielle Gemeinschaftsnetzwerke weiter zu untersuchen, da wir einen starken Einfluss der Sorte auf die Zusammensetzung der Gemeinschaft beobachteten. Allerdings ist die Stichprobengröße der vorliegenden Studie begrenzt, sodass keine ausreichende Aussagekraft besteht, um die Netzwerkstruktur zwischen einzelnen Sorten zu vergleichen. Da wir beobachteten, dass erhöhte O3-Werte die eukaryotischen Gemeinschaften stärker beeinflussten als die Bakteriengemeinschaften und dass sich eine Infektion mit Krankheitserregern auf die Bakteriengemeinschaften auswirkte, kann in diesem Fall ein Einfluss auf die Wechselwirkungen zwischen den Königreichen nicht ausgeschlossen werden. Dennoch weist die vorliegende Studie Einschränkungen bei der Bestimmung auf, wie sich spezifische und gleichzeitige Stressfaktoren auf Interaktionen zwischen Königreichen auswirken, da geeignete Methoden zur Bewertung der relativen Häufigkeit eukaryontischer Gemeinschaften anhand von Shotgun-Metagenomdaten fehlen. Es ist möglich, dass erhöhte O3-Werte einen Einfluss auf die Wechselwirkungen zwischen Königreichen haben, wie bei anderen abiotischen Stressfaktoren gezeigt wurde [30].

Insgesamt hat unsere Studie gezeigt, dass mikrobielle Gemeinschaften auf eine Veränderung reagieren, indem sie nicht nur die Zusammensetzung der Gemeinschaft, sondern auch die Interaktionen zwischen Mitgliedern und die Gesamtfunktion der Gemeinschaft verändern. Diese Arbeit liefert eine Grundlage für unser Verständnis der komplexen Reaktion mikrobieller Gemeinschaften und ihrer Wechselwirkungen mit dem Wirtsgenotyp als Reaktion auf ein sich änderndes Klima. Da sich Pflanzen in Verbindung mit ihren Mitgliedern des Phyllosphären-Mikrobioms entwickelt haben, hat sich gezeigt, dass die in dieser Studie identifizierten Gemeinschaftsmitglieder besonders anfällig für eine Verschiebung der Reaktion auf abiotischen Stress oder kombinierten Stress sind. Die Ergebnisse dieser Studie sind von entscheidender Bedeutung für die Bewertung zukünftiger Arbeiten zur Nutzung des Mikrobioms für stresstolerante Pflanzen.

Die aus dieser Arbeit generierten Sequenzdaten wurden in der SRA-Datenbank (Sequencing Read Achieve) unter den BioProject-Zugängen PRJNA889178 hinterlegt. Alle anderen in dieser Studie verwendeten Daten und Codes sind im folgenden GitHub-Repository verfügbar (https://github.com/Potnislab/AtDep_2021_metagenome).

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Referenzen herunterladen

Wir danken Auston Holland für seine Unterstützung bei der Pflege der Pflanzen im Gewächshaus und während des gesamten Experiments. Wir danken den Mitgliedern der Labore Potnis, Leisner und Sanz-Saez für ihre Hilfe bei der Erstbepflanzung. Wir danken Seth Johnston für die Einrichtung und Wartung der OTCs und der Begasung. Wir danken Dr. David Young und den Mitarbeitern der Alabama Supercomputer Authority für die Bereitstellung der für die Durchführung dieser Arbeit erforderlichen Rechenressourcen.

Diese Arbeit wurde von der Alabama Agricultural Experiment Station und dem Hatch-Programm (Projekt Nr. 10108601) des National Institute of Food and Agriculture des US-Landwirtschaftsministeriums unterstützt.

Abteilung für Entomologie und Pflanzenpathologie, Auburn University, Auburn, AL, 36849, USA

Rishi Bhandari & Neha Potnis

Abteilung für Pflanzen-, Boden- und Umweltwissenschaften, Auburn University, Auburn, AL, 36849, USA

Alvaro Sanz-Saez

Abteilung für Biowissenschaften, Auburn University, Auburn, AL, 36849, USA

Courtney P. Leisner

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NP, ASS und CPL konzipierten und gestalteten die Studie. RB trug zum experimentellen Design bei, führte die Probenentnahme und -verarbeitung durch. RB und NP analysierten die Daten und verfassten das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren.

Korrespondenz mit Neha Potnis.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bhandari, R., Sanz-Saez, A., Leisner, CP et al. Xanthomonas-Infektionen und Ozonstress beeinflussen deutlich die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur und die Wechselwirkungen in der Pfefferphyllosphäre. ISME COMMUN. 3, 24 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00232-w

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Eingegangen: 25. Oktober 2022

Überarbeitet: 08. März 2023

Angenommen: 15. März 2023

Veröffentlicht: 27. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00232-w

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